罕见病，又称为“孤儿病”，一般为慢性的严重性疾病，常危及生命。罕见病种类已达8000多种，只有不到1%的疾病具有可行的治疗方案，其中80%以上的罕见病是由遗传因素导致的，50%以上的罕见病会在出生时和儿童期发病。中国约2000万的罕见病患者，且每年新增患者超过20万。单基因遗传病是由单个基因突变导致，其中11%属无义突变类型，即编码氨基酸的密码子突变为提前终止密码子（premature termination codon, PTC），又称为PTC疾病。

杜氏肌营养不良症 (Duchenne muscular dystrophy)，简称DMD，是一种X染色体隐性遗传病，由编码肌营养不良蛋白的基因突变引起，主要在男孩中发病。据统计，全球平均每3500个新生男婴中就有一人罹患此病，我国的发病率高于此比例。患者一般在3-5岁开始发病，最早表现出进行性腿部肌无力，导致不便行走。12岁时失去行走能力，20岁-30岁因呼吸衰竭而死亡。

基因密码子拓展技术利用终止密码子编码人工合成氨基酸（unnatural amino acid, UAA）的前沿生物技术，可精准的用于PTC位点引入UAA，而不影响蛋白正常终止密码子的翻译功能。此项技术主要使用aaRS（aminoacyl-tRNA synthetase）/tRNA正交系统在发生无义突变的位点通读突变密码子，达到翻译全长蛋白的治疗目的。

2021年8月2日，Nature Biomedical Engineering在线发表了夏青团队的研究成果“Restoration of dystrophin expression in mice by suppressing a nonsense mutation through the incorporation of unnatural amino acids”的研究论文，该研究首次实现了利用基因密码子扩展技术恢复内源性Dystrophin蛋白的全长表达，在肌肉干细胞和pylRS/mdx小鼠疾病模型上系统评价了该方法用于治疗DMD的安全性、有效性和可行性，并完成了不同方式递送AAV-pylRS-tRNApyl的治疗效果评价，为DMD和无义突变罕见病治疗提供了新策略。此项研究已于2016年申报中国和美国专利，目前正积极投入临床前实验研究中。

Figure 1. The strategy of UAA-controlled gene therapy for nonsense mutation diseases.

在本课题中，研究者选择了吡咯赖氨酸系统PylRS-tRNAPyl，该系统可以将非天然氨基酸NAEK定点插入到蛋白质。研究者首先拓展了可以通读3种提前终止密码子的PylRS-tRNAPyl系统，在HEK293T细胞中验证非天然氨基酸NAEK依赖性和正交性。然后，研究者构建了含不同PTC位点的dystrophin模型蛋白Dp71b，将其质粒与PylRS-tRNAPyl系统质粒共同转染给HEK293T细胞，证明3种正交系统均可通读模型蛋白Dp71b。进一步，研究者在从疾病模型mdx小鼠和DMD病人分离得到的肌肉分化干细胞上进行验证，均检测到dystrophin蛋白的表达恢复，初步验证PylRS-tRNAPyl系统可以在细胞水平恢复内源Dystrophin蛋白的全长表达。

在动物层面上，研究者首先尝试将PylRS-tRNAPyl质粒直接电穿孔转染到小鼠的胫前肌中，dystrophin可恢复少量表达，初步表明了该方法可以在mdx小鼠上恢复内源蛋白表达。为进一步评价该方法用于DMD疾病不同组织的长期治疗效果，解决电转对小鼠组织的损伤和质粒降解问题，研究者创新性的建立了含有编码新型氨基酸的pylRS-tRNApyl正交转基因小鼠，将其和发病mdx小鼠交配获得PylRS/mdx转基因疾病小鼠模型，此模型可以稳定表达PylRS/tRNAPyl系统并呈现mdx小鼠类似的dystrophin缺陷，因此适合长期治观察疗效。对小鼠进行8周的腹腔注射NAEK，在第1, 2, 4, 6, 8周分别对小鼠进行握力测试，肌肉组织dystrophin蛋白表达量检测，血液生化检测，组织病理染色分析及安全性评价。结果发现实验组小鼠在注射NAEK第4周后蛋白恢复量达到平台期（30%左右），与对照组小鼠相比，第4, 6, 8周实验组小鼠的握力明显增加，CK激酶含量下降，肌肉组织的正常肌细胞的比例明显上升，表明该方法可恢复小鼠dystrophin蛋白全长表达及其部分生理功能，治疗效果显著，远优于小分子通读药物治疗。

最后，为评价该方法推向临床治疗应用的可行性/可转化性，研究者用AAV作为载体构建了AAV-PylRS-tRNAPyl系统，以腹腔注射和肌肉注射两种方式，分别评价其在mdx小鼠上的全身/局部治疗效果，两种方式注射AAV-PylRS-tRNAPyl均有明显治疗效果，均呈现出NAEK依赖性，可以通过停用或调整非天然氨基酸的用量来控制基因治疗的效果，有望实现精准的可控治疗。

综上，本项研究使化学家建立的体外蛋白质定点标记技术突破性的走进医学的世界，实现了在体内任一氨基酸的精准替换，拓展了人工合成氨基酸在生物医学中的广阔应用前景。并且首次实现 人工氨基酸正交翻译体系在无义突变疾病中的实验性治疗，这是继小分子化合物通读药物、单碱基基因编辑之后的第三种通用治疗罕见病的方法，有望引领新一代生物治疗的医学前沿阵地。

北京大学药学院夏青教授在生命科学相关领域有着多重交叉学术背景，所涉及方向有临床医学、免疫学、神经科学、无机化学及化学生物学，具有敏锐且新颖的科学研究视角，立足前沿生物技术领域，承担国家重大科研项目。北京大学药学院夏青课题组史宁宁，杨琦，张浩然博士为该论文的共同第一作者，夏青教授为唯一通讯作者。这项工作得到北京大学天然药物及仿生药物国家重点实验室和药学院大力支持。该课题得到国家“重大新药创制”科技重大专项支持（2018ZX09711003和2018ZX09J18114）。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41551-021-00774-1

（北京大学药学院）